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在石家庄跟世界一流较劲,韩春雨“一鸣惊人”


2016-09-20

  令人吃惊的是,河北科技大学副教授韩春雨团队的研究优于麻省理工、哈佛、斯坦福等名校的同行

  2016年5月2日,韩春雨与合作者的文章终于发表了―先被《科学》(Science)审稿小半年后拒稿,后历时9个月终被《自然生物技术》(Nature Biotechnology)接收。
  
  接下来的几天里,他每天都会收到几十上百封来自同行的邮件,但并非每封都能及时回复。
  “实验室人手有限,处理不过来那么多邮件,还望同行海涵。”韩春雨在电话里说,满是歉意。他和合作者发明的新的基因编辑技术,正引起国内同行的热切关注。他们纷纷追问:“谁是韩春雨?”

更精确,效率更高
  42岁的韩春雨是河北科技大学副教授,因为新发表的工作“一鸣惊人”。
  简单地说,韩春雨团队发明了一种新的基因编辑技术(NgAgo-gDNA),适合在人类细胞中基因组编辑,不同于已有最时兴的技术(CRISPR-Cas9)。后者通过RNA寻找替换序列,而新技术通过DNA作为介导寻找替换目标。
  NgAgo是短语Natronobacterium gregoryi Argonaute的简称。韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute实现了DNA引导的基因组编辑,并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶,适合在人体细胞中进行基因组编辑。
  Argonaute作为一个核酸内切酶家族,最早由荷兰瓦赫宁恩大学的约翰-范德欧斯特研究组证明这一家族的同源蛋白酶活,可以有效地利用单链脱氧核糖核酸作为短介质,去相对精准地切割基因组靶点。
  范德欧斯特的这一发现开启了基因组工程的新篇章,因为之前的大多数基因组工程研究是基于RNA的(CRISPR-Cas9、TALEN等,锌指蛋白是基于DNA的但是没有实现可编码的优势),哈佛大学分子与细胞生物系副研究员段昕认为,“这一进展给大家引入了一个新的思路去进一步改造”。 韩春雨对自己的工作很有自信
  目前世界各个实验室最为流行的基因编辑工具是CRISPR-Cas9。从原理上来说,早期的DNA编辑技术是通过蛋白(如锌指蛋白)来寻找需要替换的序列,Cas9则是通过RNA(引导RNA,即gRNA)来寻找替换的序列,由于比操作蛋白质简单得多,Cas9技术迅速被广泛使用。
  但是,Cas9需要19个配对的碱基,并且要求在需要编辑的基因组上这19个碱基后面必须紧邻一个符合一定特征的三碱基序列(PAM序列),这在一定程度上限制了gRNA的设计,而NgAgo�CgDNA系统不需要PAM序列,拓宽了其设计范围。
  NgAgo结合24个碱基的gDNA,比Cas9的gRNA(19个碱基)要长5个碱基,理论上其精确性要提高1024(4的5次方)倍。DNA编辑相当于在一本书中的某个位置找到一个单词将它替换成另一个单词,并且要保证书中其它地方的单词不被替换。显而易见,如果替换的是the这样的简单单词,那么可能从书中找到多个地方,而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi这样的单词则不太可能找错。
  韩春雨团队的研究还发现,NgAgo�CgDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率,如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性,特别是一些富含GC序列的地方,NgAgo系统比Cas9系统效率更高。
  韩春雨团队在论文中还介绍,与Cas9相似,Argonautes在基因表达抑制及抵御外源核酸中起关键作用。但是,Argonautes在许多方面不同于Cas9。比如,Cas9只存在于原核生物中,而Argonautes在进化过程中保守,存在于几乎所有生物体中;尽管大多数的Argonautes结合单链(ss)RNAs,在RNA沉默中起重要作用,一些Argonautes却可以结合ssDNAs并切割靶DNA;正确的Cas9结合要求向导RNA必须有一个3′RNA-RNA杂化结构,Argonaute结合则不要求特异的一致的向导RNA二级结构;Cas9只可以切割PAM上游的靶序列,而Argonaute不要求靶序列上存在特异的序列。当Argonaute与向导序列结合时,它们可以影响彼此的生物化学特性,并作为一个整体起作用。
  “因此,从理论上说,NgAgo的脱靶率更低”,韩春雨说。 荷兰瓦赫宁恩大学约翰-范德欧斯特研究团队
“幸好NgAgo足够给力”
  韩春雨是石家庄人,本科毕业于石家庄的河北师范大学,他父母也在该校任教。
  1995年,韩春雨来到北京,先在中国农业科学院攻读硕士学位,后在中国协和医科大学(中国医学科学院)接受博士研究生训练,2003年获得博士学位。此后,他并没有寻找教职,在协和的实验室继续一项关于“人类Bex2与LMO2相互作用、调节新型DNA结合复合物的转录活性”的研究,2005年该结果发表在《核酸研究》(Nucleic Acids Research),韩春雨为第一作者,这篇文章也成为他科研生涯中具有标志性的成果。   2006年,32岁的韩春雨离开北京,到河北科技大学担任教职。十年后,他发表了独立研究生涯以来最为重要的工作。
  韩春雨的研究方向是真核基因表达调控,特别是和肿瘤相关的基因,以及表观遗传相关蛋白,RNA的功能研究,例如,长非编码RNA的功能及其他。近些年基因编辑技术,尤其是CRISPR-Cas9的不断完善,深刻地影响到整个生命科学领域,韩春雨的实验室也用上了CRISPR-Cas9这一工具,他本人也一直在关注基因编辑领域的进展,有过一些想法,但并没有下决心动手。
  促使韩春雨真正动手的是2014年年初的两篇文献,其中一篇是范德欧斯特研究组发表在《自然》(Nature)杂志的。段昕介绍,范德欧斯特工作的局限性在于他们实验所需要的温度在65-75摄氏度,这使得很多实验不能在生理条件(哺乳动物在37摄氏度左右)下完成。
  当时,北京大学一位研究员得知范德欧斯特的研究后非常兴奋。他判断,TtAgo可以发展为一个更简单的基因编辑工具,并产生了一个想法:哺乳动物中是否在特定时期或特定细胞中存在类似现象,比如决定细胞分化或抗体形成的过程。不过,他的实验室在合成了人源密码子优化的TtAGO 后,尝试了几次切GFP序列,却以失败告终。
  几乎在同一时间,韩春雨的实验室进展则十分顺利,“大概是两个月就有结果出来了”。
  段昕介绍,韩春雨团队做的,就是进一步搜寻Argonaute的同源蛋白。幸运的是,大量的已知大型测序数据给了他们很多有效的帮助,找到并进一步证明了来自不同菌株格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute同源蛋白可以在生理条件下实现类似的功能。“韩的工作把系统进一步优化,而且使得短介导DNA的准确性和识别长度有了重大突破。”段昕说。
  北京大学生命科学学院研究员魏文胜课题组也想尝试DNA介导的Argonaute,但TtAGO的特点是工作温度比较高。“这篇文章比较聪明,还是走对了路,没有研究如何使高温才能工作的酶通过构象改变达到降温,而是找到这样一株可以在37度工作的Argonaute。” 魏文胜说。
  之后,韩春雨一边向《科学》杂志投稿,一边和实验室的几个学生一起完善结果。当时文章最主要的结果是NgAgo确实可以做基因编辑工具,但“审稿人要求的比较完美”,来回审了小半年之后,“最后被拒了”。
  2014年秋天,韩春雨跟沈啸提起自己正在做的NgAgo的工作,提出了几个候选的工具。“这么好的课题和想法,我当然全力支持并加入了。”沈啸回忆道。他是浙江大学医学院基础医学系研究员,在中国协和医科大学博士毕业前一年,与韩春雨合作了发表在《核酸研究》的论文。2003年博士毕业以后,沈啸曾在美国一所大学从事博士后研究,2015年入选浙江大学“百人计划”。
  在被《科学》拒稿后,韩春雨和实验室的学生继续补充实验,而沈啸在项目和实验设计上提供建议,他们发现了更多关于NgAgo的特性。
  “幸好NgAgo也比较给力,发现它是one-guide faithful的。”韩春雨笑着说。
  2015年6月3日,这篇仅有五人署名的文章的被投往《自然生物技术》,9个月之后,文章被接收,2016年5月2日在线发表。
  “文章发出来是好事,也是坏事”
  在整个生物界唯强大的CRISPR-Cas9马首是瞻的时代,韩春雨的这一发现引发了诸多媒体和同行的热情关注。
  有评论认为,“(如果)未来中国任何一所普通的科研院校都能出现这种激动人心的科研成果,那么中国的科研实力才是真正的达到世界领先水平”。
  国内关注生物行业的媒体评价说,“该成果核心为一项替代目前通用的Cas9的基因组编辑新技术,这一成果打破了国际基因编辑技术的垄断”。
  韩春雨对此评价不敢苟同,他认为,NgAgo�CgDNA系统和Cas9都为基因编辑应用提供了更好的工具和多样化的选择,各有各的用处。
  沈啸则对NgAgo可以取代Cas9 的评价持谨慎态度,“最客观的说法是找到了新的基因编辑工具”。他认为,Cas9基因编辑系统有点复杂,每当把它某一个劣势用某种技巧修正后,使之特性更高、更有效,就会是一篇很好的论文,每进行一个改良,就是一篇CNS的论文。“大部分人包括一些科学家可能自然而然受一种权威的影响,Cas9太强大了,大家都把目光集中在Cas9上,想怎么磨这把刀,把它做得更好更漂亮。”
  正是因为Cas9太热,很多人就忽视了去寻找更好的甚至先天就可以规避这些问题的工具。前述的北京大学研究员透露,他们2014年也在做TtAGO的实验,但部分因为依赖Cas9而放弃继续研究Argonaute 。“学生觉得不太靠谱,而实验室里其他人Cas9 用得十分熟练,都觉得没有必要再换了,我也没有坚持。”他不无遗憾地说。
  韩春雨团队的工作已经证实了一个新的、有自己特点和优势的基因编辑工具,但是如何利用它,找到它更多的特性,还有很多工作要做。
  “我和韩春雨现在是非常非常急迫的心理,文章发出来是好事也是坏事,好事是这项工作让大家知道了,坏事是大范围的竞争,我们的工作是不是能赶上趟,继续做下去,是不是我们中国的科学家还能继续报道它。”沈啸说,国外的很多实验室设备条件非常强,“我们没法比,他们一上来做的话,很多东西会很快出结果。” 石家庄的四人实验室
  无论是在微信圈还是海外华人的论坛,人们不约而同地将韩春雨和麻省理工学院博德研究所的核心研究员张锋联系起来。1981年出生的张锋同样来自石家庄,以在基因编辑领域的诸多贡献而被人们所熟知,包括首次报告了CRISPR-Cas9在哺乳动物体基因组编辑中的应用,找到更小的Cpf1蛋白来替代Cas9酶。
  与韩春雨一直在国内接受科学训练、从事研究不同,张锋有海外学习的背景,更有在知名实验室研究的经历。11岁那年,张锋随母亲到美国爱荷华州的得梅因定居,高中时就在一个基因治疗实验室实习,全奖进入哈佛大学学习化学和物理学,期间跟随知名华人科学家庄小威做过研究,后来到光遗传学主要发明人之一卡尔・戴瑟罗特(Karl Deisseroth)在斯坦福大学的实验室,参与到光遗传学发明的部分工作。在哈佛大学短暂地停留之后,张锋受聘于博德研究所,一个科研经费和研究人员都可以在美国排到前列的研究机构。   而在河北科技大学生物科学与工程学院的实验室,“离心机是‘飞鸽’牌,与国内自行车品牌相同,从0加速到12000转大概需要1分钟的时间,”韩春雨不无幽默地说。
  直到今天,韩春雨所在的的生物科学与工程学院还没有博士点,韩春雨实验室的学生都是硕士研究生。理论上,韩春雨每年可以招五六个硕士研究生,但是真正能够跟他一起专注科研的,也只有一两个人。
  包括《自然生物技术》的这篇论文,跟韩春雨一起做实验的一共三个人,其中第一作者高峰两年前就从河北科技大学硕士毕业,那时NgAgo的主要结果刚刚做出来,高峰没去找工作,也没有申请博士,而是留在导师韩春雨的实验室继续工作,为了省钱,甚至睡觉都在实验室。这一情景与韩春雨当年博士毕业后留在协和继续未完成的科研工作有着惊人的相似。
  “韩实验室的工作是很了不起的。”北京大学生命科学学院饶毅实验室研究生张翼评论说,“他们唯一的生物信息学工具可能是NCBI-psiBLAST,他们的Argonaute都是从菌种库买来的菌里面克隆出来,根本没有花钱合成基因。”即使是在这么艰难的工作环境下,他们不仅找到了NBT文章中报道的NgAgo,还找到了(他们专利里报道的)一大堆别的Ago,都具有在低温(10-50摄氏度)下结合5p-ssDNA,造成靶DNA双链断裂的能力。
  很多人对韩春雨能够在如此简陋的环境下取得开创性的工作感到惊讶,但在他的大学同学、河北师范大学特聘教授徐小冬眼里,她对韩春雨能够做出现在的工作一点也不感到奇怪,虽然韩春雨没有海外留学经历,但是也受到了很好的专业科学训练。她认为,对一个受过专业科学训练的科研工作者来说,占用资源的多少并不会决定他是否能够做出很好的工作。
  “他这个人蛮有个性,从来不是那种循规蹈矩的人,他能够坚持一些东西,守着自己的一亩三分地,也敢于表达自己,挑战威权……投稿能够较这么长时间的劲,说明对自己的工作很有自信。”徐小冬说。
  如今,面临四面八方涌来的合作邀请,韩春雨统统交给沈啸来处理。“他见识广,也是一个好的合作者……我主要在实验室干活,而且我也喜欢这样的生活。”韩春雨说。 清华大学医学院
  教授 鲁白
  在一所不太有名的大学,我们自己培养出的科研人员也能做出这样的成果,能够和美国的最新技术叫板,是一件了不起的事情。NgAgo-gDNA技术的知识产权掌握在韩春雨团队手中,目前还没有看到有人与之竞争,这又是一大优势。CRISPR-Cas9技术的发明者中有美国麻省理工学院的华人科学家张锋等人,也有美国加州大学的珍妮弗・杜德纳等人,由于该技术在科学上和商业上的巨大前景,双方团队正为这一技术的专利权归属打官司。我们自己掌握了知识产权,不仅有利于中国生命科学界使用这项技术,一些国外的大公司也可能会主动来付费要求得到技术授权。
  现在一些科研评价体系往往是讲名气、摆资历,不利于年轻人发挥创造性,希望能够借韩春雨的事例,呼吁中国科学界做出体制上、文化上的突破,鼓励年轻人冒头创新,这也符合国家号召创新的政策。 哈佛大学分子与细胞生物系
  副研究员 段昕
  韩的工作把系统进一步优化,而且使得短介导DNA的准确性和识别长度有了重大突破。
  我们希望看到的是更多的不同基因靶点,不同组织细胞亚型,不同的发育阶段,不同的物种和不同的递送手段(delivery method)的数据。以张锋为代表的MIT-Broad Institute的同仁在过去五年间对于CRISPR-Cas9的改进和实验应用方面做出了举世瞩目的贡献。希望NgAgo的故事会是一样的精彩激烈。这会是一场国际竞赛。祝中国韩好运!
  而这说明几点:
  第一,许多生物研究资源(比如NCBI包括pubmed,PDB,引物数据库,测序,常用载体,蛋白纯化方法)无论是MIT也好还是河北科大也好,都是可以获取的,只要你有心有想法(当然需要大型仪器和经费支撑的基因组学和结构生物学另说);
  第二, 踏实勤奋其实是好的科研必要条件,现行科研体制(美国是鼻祖,中国学自美国)有些浮夸和浮躁,更像商业运营;
  第三,也是我今天跟同学讨论的,你所在的机构越好(比如broad或者RU这种神级机构),但作为年轻独立PI你所付出的许多努力是在维持在这些院所的生存。我跟同学开玩笑说,你在哈佛医学院能当一个正教授所需具备的能力可以去一个小国家当总统了,但你把这些努力用在别的地方,可能回报率更高,而不是只维系了一个在哈佛的教授头衔。
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